실험 동물을 이용하는 기존의 항체 제조 방식과는 달리 재조합 항체는 미리 구축해 놓은 항체 유전자 풀인 라이브러리로부터 특정 항원에 결합하는 항체 후보들을 찾는 방식이기 때문에 스크리닝에 사용하는 항체 라이브러리의 규모 (number of clones)와 다양성 (diversity) 그리고 표면발현 (surface display)의 정확성이 매우 중요합니다. 이를 위해서는 항체 스크리닝에 최적화된 벡터 (vector)의 개발을 시작으로 각종 유전자 재조합 기술 (recombeering techniques) 들과 항체 유전자의 발현 조절/구조적 안정화 그리고 항체 라이브러리의 다양성 유지와 상실 (loss)을 최소화할 수 있는 최적의 항체 스크리닝 방법에 대한 많은 선행 연구들이 필요합니다.
당사는 지난 18년간 수많은 시행착오를 거치며 세계 최고 수준의 항체 라이브러리 구축기술을 확보하게 되었습니다.
▣ 재조합 항체라이브러리 제작 기술
- 항체 유전자 풀 (naive antibody gene pool) 또는 랜덤 CDR 올리고머 (random oligonucleotide)를 이용한 합성 유전자 풀 (synthetic gene pool)로 부터 PCR 기법을 이용하여 항체 유전자 라이브러리 cDNA를 제작.
- SfiI 제한절단/라이게이션 방법이나 Overlap CloningTM 방법을 이용하여 항체 유전자 cDNA를 자체 개발한 파아지 디스플레이 벡터 (phage display vector)에 클로닝.
- 평균 2-5 x 108/ug DNA의 형질전환 효율을 갖는 E.coli 컴피턴트 세포를 (electro competent cell) 제작한 후 100-500회에 걸쳐 독립적으로 형질전환하여 풀링함.
- 무작위적으로 선택한 개별 클론들의 염기서열 분석으로 항체 라이브러리의 다양성 (diversity)과 넌센스변이 (non-sense mutation)의 발생빈도를 확인함.
- 항체 라이브러리를 갖는 대장균 세포를 VCSM13 헬퍼파아지 (helper phage)로 감염시켜 배양한 후 배양액으로 부터 항체 단백질이 표면발현된 (surface displayed) 파아지 파티클을 회수함.
- 위와 같은 방법으로, 1011 크기의 다양성을 갖는 항체 라이브러리를 평균적으로 4 주 이내에 제작할 수 있음.
▣ 합성 항체 (combinatorial synthetic) 라이브러리 제작 기술
- 자연적인 항체 유전자 풀 (naive antibody gene pool) 과는 별도로 인위적인 서열로 디자인한 합성 항체 라이브러리는 항체의 다양성을 높이는 측면에서 큰 장점이 될 수 있음.
- 항체의 CDR (complementarity determining region)은 항원 특이성 (specificity)과 친화도 (affinity)를 결정하는 주요 서열로서 무작위 합성 서열의 타겟이 됨
- 20개 아미노산을 코딩할 수 있는 NNK 서열을 포함하는 랜덤 올리고머를 합성한 후 오버래핑 PCR 기법으로 셔플링 (shuffling) 하여 합성 유전자 풀 (synthetic gene pool)을 제작한 후 리더 (leader)서열을 제거한 암피실린 저항성 유전자 (∆Bla gene)의 앞부분에 클로닝하고 암피실린 배지에서 배양함. 이때 NNK의 서열에 TAG 종결코돈 (stop codon)이 오거나 또는 넌센스 변이가 있는 DNA를 가지는 세포는 암피실린 저항성을 획득하지 못하므로 생존하지 못하는 효과를 보임으로써 정상적인 서열을 갖는 라이브러리 클론들만을 선별할 수 있는 전략임.
- 일차 선별로 얻은 cDNA 풀을 SfiI 제한 효소로 절단한 후 G3P 융합 파아지미드 벡터에 2차로 클로닝하여 파아지 표면발현 항체 라이브러리를 제작함.
▣ 펩타이드 압타머 (peptide aptamer) 라이브러리 제작 기술
- 20개 아미노산을 코딩할 수 있는 NNK 서열을 포함하는 랜덤 올리고머를 합성한 후 오버래핑 PCR 기법으로 파아지미드 발현벡터에 넣어 라이브러리를 제작함.
- 9, 12, 15 개의 아미노산들로 구성된 펩타이드 라이브러리들을 독립적으로 제작한 후 풀링하여 파아지 파티클을 제조함.
- 선형 (linear)와 이황화 결합으로 원형 구조 (circular)를 형성하는 두종류의 펩타이드 라이브러리를 제작함.